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列举漆黄素对小鼠帕金森动物模型的相关研究方法

作者: 来源: 日期:2021/5/27 17:11:05 
       帕金森症是一种会引起多巴胺神经退化的进行性疑难症,日本目前约有15~20万名患者。目前虽有补充多巴胺等的对症疗法,但预防发病或者抑制病情恶化的根 治性疗法却不存在。在PD诊断出来时,多巴胺神经细胞就已经减少了50%左右。因此,亟需开发针对发病前(前驱期)的早期诊断法和新疗法。对诊断和新药开发极为重要的如实再现这种前驱状态的帕金森动物模型,也随之备受期待。接下来,帕金森动物模型公司—凯斯艾生物科技就为大家具体分析下。
       材料与方法
       材料
       漆黄素(3, 7, 3', 4'-四羟基黄酮,fisetin)、MPTP(1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶)、TH抗体(Sigma,美国);β-actin抗体(proteintech,美国);还原型谷胱甘肽(GSH)、总超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(南京建成生物,中国);甲苯胺蓝染液(Servicebio,美国)。
       实验动物
       雄性C57BL/6小鼠,12~13周龄,体重24~28 g,由上海南方模式生物公司提供。每笼饲养5只小鼠,自由进食和饮水,相对湿度40%~50%,室温20~25℃,12 h/12 h昼夜节律。实验操作流程严格遵循中国实验动物操作指南,已通过上海南方模式生物中心伦理委员会的批准(IACUC: 2018-0005)。
       实验动物分组及造模
       帕金森动物模型公司说到将小鼠随机分为3组:control组、MPTP组和漆黄素+MPTP组,每组5只,共15只。MPTP组按照30 mg/kg的剂量连续5 d腹腔注射,复制小鼠帕金森动物模型。漆黄素+MPTP组小鼠给予100 ng/kg漆黄素(溶于含1%DMSO的PBS溶液配制)连续灌胃30 d,control组和MPTP组同时给予等量含1%DMSO的PBS溶液灌胃。在漆黄素给药的第26~30 d,漆黄素+MPTP组给予MPTP连续腹腔注射5 d。
       行为学实验
       旷场实验
       实验开始前,将小鼠放至实验环境中适应半小时。将小鼠放置于实验箱(40 cm×40 cm)底部的中央区域。利用旷场工作站(MED Associates, Georgia, VT, USA),连续采集并分析15 min内小鼠的平均速度、运动总距离等指标。
       爬杆实验
       自制爬杆装置,并对各组小鼠进行爬杆训练。MPTP末次注射后的次日进行爬杆实验。将小鼠头朝上,上肢放在杆顶端(高80 cm,直径1 cm)。小鼠从放置到全身朝下的时间为掉头时间,从放置到后肢着陆的时间为总时间。每只小鼠测试3次,每次测试间隔1 h以上。
       悬挂实验
       自制悬挂实验装置(中间铁丝直径2 mm,长50 mm;两端平台高35 cm),将小鼠前爪放于铁丝中间以悬挂小鼠。记录180 s内小鼠掉落的次数以及到达两端平台的次数,并根据参考文献[9]计算得分。小鼠的基础分数设为10分,每掉落1次减去1分,到达平台1次则加1分。帕金森动物模型公司说到小鼠中途掉落或者到达平台后将其重新悬挂,直至计时达到180 s。
       蛋白免疫印迹
       行为学实验结束后,对小鼠进行灌注并取材。取小鼠一侧新鲜脑组织,将纹状体剥离并加入适量的含PMSF的RIPA裂解液匀浆后,4℃、12 000 r/min,离心15 min。取上清液,采用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白,将分离的蛋白质转移至0.45 μm的PVDF膜上。5%的脱脂牛奶封闭膜120 min以抑制非特异性结合。随后按照蛋白分子量裁剪目标条带,对应TH抗体和β-actin抗体4℃冰箱摇床孵育过夜。次日,TBST清洗3次后,将目标条带与对应种属的二抗室温孵育1 h,蛋白印迹智能成像系统扫描。
       免疫荧光
       取小鼠另一侧半脑,放入4%的多聚甲醛中固定24 h后,参考小鼠脑图谱制备小鼠脑组织黑质区的石蜡切片。将石蜡切片放入二甲苯中脱蜡后,放入不同梯度的乙醇中水合。随后将切片置于pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中煮沸修复8 min,用组化笔在脑组织周围画阻水圈,向阻水圈内滴加免疫荧光封闭液,37℃封闭2 h后,加入TH抗体于4℃冰箱孵育过夜。次日,PBST清洗后加入免疫荧光二抗,放置于湿盒中37℃避光孵育30 min。用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片后,在荧光显微镜下观察。
       尼氏染色
       将小鼠脑组织黑质的石蜡切片依次放入二甲苯和梯度乙醇中脱蜡和水合。在切片上滴加甲苯胺蓝染液染色5 min,流水洗净。加入1%的冰醋酸适当分化后,二甲苯中透明5 min并用中性树胶封片。
       氧化应激指标测定
       取适量的小鼠纹状体组织,加入9倍预冷的生理盐水于冰上制备10%的组织匀浆,随后3 000~4 000 r/min,离心匀浆液10 min,取上清液并严格按照说明书操作,进行氧化应激指标GSH、SOD、T-AOC、MDA的检测。
       统计学方法
       使用SPSS 21.0软件和GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析。检验水准取双侧α=0.05,以P < 0.05为差异有统计学意义。Adobe Illustrator CC 2018绘图。
       以上就是帕金森动物模型公司—凯斯艾生物科技为大家整理发布的。凯斯艾生物科技(苏州)有限公司(珂玛麒)是一家研发关节炎动物模型,肺损伤模型。急性肾损伤模型,心肌梗死动物模型,帕金森动物模型,糖尿病动物模型以及脑梗死模型等,提供专业的临床前药理药效学评价服务。

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